ELISA

- Введение
- Растворы
- Сорбция антител на поверхность подложки
- Блокировка
- Инкубация с антигеном
- Инкубация с антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена
- Проведение ферментативной реакции 
- Остановка ферментативной реакции 

Введение

Иммуноферментный анализ «сэндвич» типа («сэндвич»-ИФА) - лабораторный иммунологический метод выявления антигенов. Общая схема проведения метода заключается в следующем. На твердой фазе адсорбированы антитела к исследуемому антигену. После инкубации исследуемого материала и образования комплекса «антитело — антиген» проводится удаление несвязавшихся компонентов, добавляется конъюгат, т.е. антитела к искомому антигену, меченые ферментом. По завершении инкубации, с последующим удалением непрореагировавшего коньюгата промывкой, образуется комплекс, в котором антиген как бы заключен между двумя слоями антител. Наличие меченных ферментом антител определяется при помощи соответствующего субстрата.

Растворы

Буфер для иммобилизации
20 мМ Na₂CO₃

Проверить pH и довести до pH 9,6

Буфер для блокировки
150 мМ NaCl
10 мМ Na₂HPO₄
1 мг/мл альбумина быка (BSA)

Проверить pH и довести до pH 7,5

Буфер для промывки (PBST)
150 мМ NaCl
10 мМ Na₂HPO₄
0,2% Tween-20

Проверить pH и довести до pH 7,5

Буфер для промывки (PBST)
150 мМ NaCl
10 мМ Na₂HPO₄
0,2% Tween-20

Проверить pH и довести до pH 7,5

Буфер для разведения (PBS)
150 мМ NaCl
10 мМ Na₂HPO₄

Проверить pH и довести до pH 7,5

В лунки 96-ти луночного планшета для проведения иммуноанализа добавьте 100 мкл буферного раствора для иммобилизации, содержащего антитела. Мы рекомендуем использовать конечную концентрацию антител для иммобилизации в диапазоне 5-10 мкг/мл. Проведите инкубацию в течение 2 часов при комнатной температуре и постоянном перемешивании на горизонтальном шейкере для планшетов, либо в течение ночи при +4℃. Для удаления несвязавшихся антител, промойте 1 раз планшет буферным раствором для промывки (PBST)

Блокировка

Для блокировки мест неспецифичного связывания в лунки планшета внесите по 200 мкл буферного раствора для блокировки. Проведите инкубацию в течение 30-40 минут при комнатной температуре и постоянном перемешивании. Проведите отмывку раствором PBST 3 раза.   

Инкубация с антигеном
 

Инкубация с антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена 

В лунки планшета внесите по 100 мкл раствора специфичных антител, конъюгированных с ферментной меткой. Оптимальная концентрация большинства конъюгированных антител производства ООО фирмы «Имтек» составляет 0,1 мкг/мл. Проведите инкубацию при комнатной температуре в течение 60 минут при постоянном перемешивании. Для удаления несвязавшихся конъюгированных антител, проведите отмывку планшета раствором PBST 5-6 раза.

Проведение ферментативной реакции   

В лунки планшета вносят по 100 мкл раствора  субстрата (ТМБ) и инкубируют в течение 5-10 минут при комнатной температуре и постоянном перемешивании, в защищенном от света месте до появления в лунках синего окрашивания разной интенсивности 

Остановка ферментативной реакции   

Остановка реакции проводится добавлением в каждую лунку планшета по 50 мкл 0,5М серной кислоты. Окраска стабильна в течение 30 мин

Измерение оптической плотности 

Оптическая плотность раствора окрашенного продукта измеряется при длине волны 450 нм с использованием планшетного спектрофотометра